В лабораторию обратилась врач МГНЦ Бессонова Людмила Александровна с просьбой выявить вторую мутацию в гене PALB2 при анемии Фанкони у ребёнка в семье, проходившей консультацию и разработку ПГД в лаборатории «Генетико». При секвенировании экзома ребёнка был обнаружен только один описанный раннее патогенный вариант c.172_175del, унаследованный от матери. Отцу было также проведено секвенирование экзома в лаборатории «Геномед», однако значимых вариантов не было обнаружено. MLPA анализ ДНК отца также не выявил структурных нарушений в гене PALB2.

Биоинформатиком Ф.А.Коноваловым была выдвинута гипотеза, что второй вариант может находиться в интроне и влиять на сплайсинг или экспрессию гена PALB2. Для установления аномальной структуры мРНК гена PALB2 её последовательность была разделена на 6 перекрывающихся участков, структура каждого из которых была проанализирована методом ПЦР с обратной транскрипцией. Для анализа использовали РНК, выделенную из крови отца пробанда. В результате, был обнаружен аномальный транскрипт с пропуском 11 экзона. Для дальнейшего поиска интронного варианта в гене PALB2 было проведено секвенирование по Сенгеру геномной ДНК отца в районе 11 экзона. Таким способом была выявлена гетерозиготная делеция в 10 интроне c.3114-16_3114-11del. Её влияние на структуру мРНК гена PALB2 было подтверждено с использованием системы экспрессии минигена.

Пропуск 11 экзона приводит к сдвигу рамки считывания и как следствие к образованию белка с укороченным WD40 доменом. По данным литературы, белок с подобной структурой не является функциональным.

В нашу лабораторию обратилась научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии МГНЦ Васильева Татьяна Алексеевна. Ранее в лаборатории генетической эпидемиологии было проведено исследование 177 пациентов с диагнозом врожденная аниридия из 144 семей Российской Федерации методами MLPA и прямого секвенирования по Сенгеру гена PAX6. В результате было выявлено 96 вариантов в гене PAX6, 20 из которых предположительно влияют на сплайсинг. 10 из этих вариантов находились в положениях ±1/2, 8 – в других областях интрона. Кроме того, были выявлены одна миссенс и одна синонимичная замены, которые предположительно влияют на сплайсинг. Нашей задачей стало исследование предположительного влияния выявленных вариантов на сплайсинг пре-мРНК PAX6.

Нами было проведено исследование 6 интронных вариантов в гене PAX6, находящихся вне позиций ±1/2, а также одной синонимичной и одной миссенс замены с использованием системы экспрессии минигена в модельной клеточной линии. В ходе работы нами было установлено, что 7 вариантов оказывают влияние на сплайсинг пре-мРНК PAX6, в том числе миссенс (c.140A>G) и синонимичный (c.174C>T) варианты, тогда как один из интронных вариантов (c.142-64A>C) не показывает эффекта на сплайсинг. Все выявленные изменения структуры мРНК приводят к образованию преждевременного стоп-кодона и запуску механизма нонсенс-опосредованной деградации (NMD) мРНК, что в результате и приводит к гаплонедостаточности функции гена PAX6. Таким образом, нами было выявлено, что доля мутаций сплайсинга в гене PAX6 при врожденной аниридии значительно выше, чем было принято считать ранее. В результате данной работы, удалось установить точный молекулярно-генетический диагноз 6 пациентам.

Результаты данной работы были опубликованы в журнале ESHG

В лабораторию функциональной геномики обратилась врач-генетик МГНЦ Л.А. Бессонова с просьбой оценить патогенность вариантов нуклеотидной последовательности c.1932-3A>G и c.2613+1G>A в гене KIAA1109, обнаруженных у плода с множественными пороками развития. Пациентка с мужем обратились с третьей неудавшейся беременностью, прерванной на 14 неделе. У плода наблюдались вентрикуломегалия, артрогрипоз, отек мягких тканей головы и туловища и другие пороки развития. Кариотип родителей был в норме. Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) ДНК плода не выявил отклонений. В дальнейшем в лаборатории «ГЕНОМЕД» было проведено полноэкзомное секвенирования ДНК плода, в результате чего были обнаружены два варианта с неизвестным клиническим значением в гене KIAA1109. Данный ген ранее не был ассоциирован с моногенными заболеваниями. Однако в литературе была описана гомозиготная мутация в данном гене у пациента с мальформацией Денди-Уокера, гидроцефалией, артрогрипозом, микрогнатией и другими нарушениями.

Проведенный нами биоинформатический анализ данного гена выявил его высокую консервативность, широкий спектр взаимодействий и высокую экспрессию в эмбриональном периоде. Кроме того, было известно, что модельные мыши с нокдауном данного гена не переживали эмбриональную фазу развития. В результате проведенного анализа был сделан вывод, что варианты в данном гене являются кандидатами для объяснения клинической картины пациентов. Проведенный нами сегрегационный анализ выявленных вариантов показал их транс-положение. Более того, ОТ-ПЦР анализ РНК выделенной из крови пациентов выявил, что замена c.1932-3A>G приводит к удлинению экзона 17 на 2 нуклеотида со сдвигом открытой рамки считывания и синтезом укороченного белка, а замена c.2613+1G>А приводит к пропуску 20 экзона, что приводит к пропуску 46 аминокислот в белке KIAA1109. Таким образом, оба исследуемых варианта нарушали нормальную функцию гена.

В процессе проведения нашей работы Gueneau et al. (2018) опубликовали работу, в которой описали новый синдром Алкурая-Кучинскас, вызываемый гомозиготными и компаунд-гетерозиготными мутациями в гене KIAA1109. Фенотипические проявления данного синдрома хорошо соответствовали выявленным у пациентов. Проведенный авторами работы функциональный анализ позволил нам переклассифицировать исследуемые варианты как патогенные. И на основании этого, супругам была успешна проведена пренатальная диагностика четвертой беременности, окончившаяся рождением здорового ребенка.

Результаты данной работы были опубликованы в журнале Clinical Genetics